跑酷张磊

时间:2024-03-20 08:42:26编辑:分享君

loxp-frt-neo-frt是什么,有什么作用

loxp-frt-neo-frt 是一个打靶用工具载体(pL451)的主要元件。
另外,还有另一个工具载体loxp-neo-loxp(pL452)。

在条件型基因打靶时,先在需敲除的Exon一侧加入一个loxp-neo-loxp,成为exon-loxp-neo-loxp,通过阿拉伯糖诱导EL350菌表达cre酶,删除两个loxp间的片段,留下一个loxp,成为exon-loxp,再将loxp-frt-neo-frt插入在需敲除的Exon另一侧,成为loxp-frt-neo-frt-exon-loxp,从而实现对Exon 的锚定。

先说一下 neo, Cre-loxp 系统和 Flp-FRT系统

neo:
是对新霉素(neomycin)的抗药基因。细胞表达该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素,破坏卡那霉素和新霉素(原核生物)以及G418(geneticin)(在真核生物)。
该基因往往被克隆到表达载体,作为筛选基因

Cre-loxp 是一个基于传座效应的DNA片段同源重组系统。
1.Cre是一个重组酶,可以识别一段DNA序列中相邻的两个loxp片段,并将两个loxp间的DNA序列剪切,在原位点上只留下一个loxp,也可在两段都带有两个相邻loxp序列的DNA序列间介导同源重组,达到交换DNA片段的目的。
2.loxp是一个有独特结构的序列,一共34bp,它由内部8bp的中心序列以及两侧13bp的回文重复序列组成。

Flp-FRT 与 cre-loxp 系统的原理相似。
Flp 重组酶也是基因敲除中常用的一个重组酶来自酵母。Flp重组酶能将两个FRT 位点之间的片段删除。FRT与loxp的结构相同,但序列不同。

带有这个载体结构的中靶细胞能表达neo 基因,从而在筛选中活下来,
筛选基因的存在可能会对基因功能的研究产生不可预料的影响,这时就可以用 Flp-FRT 系统,将筛选基因以及FRT位点删除。

在loxp与第一个FRT 位点间一般是需敲除基因的外显子,使用cre-loxp 系统就能把两个loxp 间的片段全部删除。

把中靶细胞注射到囊胚中,再移植到假孕鼠体内,发育得到带有以上载体骨架的小鼠,再与表达cre 或者 flp重组酶工具鼠交配,就可以在后代中实现基因的敲除,也可以在中靶细胞的培养中使用cre 或 flp重组酶。

个人理解 :loxp 与 FRT在基因敲除中起到一个锚定目的基因,让核酸重组酶识别并删除的作用。


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